An In-house Method for Molecular Monitoring of BCR-ABLHakkı Ogun Sercan, Ilgın Öztürk, Ceyda Çalışkan, Melek Pehlivan, Zeynep SercanDokuz Eylul University Faculty Of Medicine,depatment Of Medical Biology And Genetics, Izmir, Turkey
OBJECTIVE: At present in Turkey, centers that are able to give reliable RQ-PCR BCR-ABL results are limited in number. We aimed to describe a cost-effective, in-house method for BCR-ABL quantification and to illustrate an example for RQ-PCR validation tests.
METHODS: BCR-ABL and ABL target sequences were cloned into pJET1.2 vectors; from which calibrators were prepared and used as templates in RQ- PCR reactions to generate standard curves. Dilutions of K562 cells (representing an in vitro simulation of BCR-ABL transcript reduction) were analyzed.
RESULTS: Previously determined standard curves were used to calculate the BCR-ABL and ABL copy numbers. Linear BCR-ABL results were obtained. Repetitive experiments showed that our methodology is able to detect one BCR-ABL positive cell in a total of 1x105 cells.
CONCLUSION: The approach described in this manuscript is suitable for implementation into any RQ-PCR instrument and/or kit aiming to quantify BCR-ABL transcripts.
Keywords: Chronic myeloid leukemia, BCR-ABL, real-time PCR, molecular response
BCR-ABL Moleküler Takibi İçin Optimize Edilmiş Manuel Bir YöntemHakkı Ogun Sercan, Ilgın Öztürk, Ceyda Çalışkan, Melek Pehlivan, Zeynep SercanDokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakultesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik AD, İzmir, Türkiye
AMAÇ: Türkiye’de BCR-ABL gerçek zamanlı kantitatif PZT ile BCR-ABL düzey tayini yapabilen merkezlerin sayısı, ihtiyacın altında kalmaktadır. BCR-ABL kantitasyonu için laboratuarımızda geliştirmiş olduğumuz yöntem temel alınarak, polimeraz zincir tepkimesiyle (PZT) ile kantitasyonun basamakları, iç kontrolleri ve geçerlilik testleri anlatılmıştır.
YÖNTEMLER: BCR-ABL ve ABL hedef dizileri pJET1.2 vektörlerine klonlandıktan sonra kalibratörler hazırlanmış ve gerçek zamanlı PZT tepkimelerinde kalıp olarak kullanılarak standart eğriler çizilmiştir. Bu standart eğriler kullanılarak K562 hücre dilüsyonlarının analizi yapılmıştır.
BULGULAR: Önceden elde edilen standart eğriler kullanılarak BCR-ABL ve ABL kopya sayıları hesaplanmış; lineer sonuçlar elde edilmiştir. Tekrarlayan deneylerle yöntem duyarlılığının 1x105 hücrede bir BCR-ABL pozitif hücreyi saptayacak düzeyde olduğu gösterilmiştir.
SONUÇ: Bu makalede tarif elden protokollerin geçerliliği/güvenirliliği gösterilmiştir. Kullanılan yaklaşım, BCR-ABL kantitasyonunun hedefleyen diğer gerçek zamanlı PZT kit ve cıhazlarına da uyarlanabilmektedir.
Anahtar Kelimeler: Kronik miyeloid lösemi, BCR-ABL, gerçek zamanlı PZT, moleküler yanıt
Hakkı Ogun Sercan, Ilgın Öztürk, Ceyda Çalışkan, Melek Pehlivan, Zeynep Sercan. An In-house Method for Molecular Monitoring of BCR-ABL. Turk J Hematol. 2012; 29(4): 348-353
Corresponding Author: Hakkı Ogun Sercan, Türkiye |
|