Using PCR and Real-Time PCR (LightCycler) for Diagnosis and Follow up of Invasive Fungal Infections in Patients with Hematological Malignancies and TransplantationNilgün Işık1, Ken Mills21Department Of Microbiology And Clinical Microbiology, Istanbul Medical Faculty, University Of İstanbul, İstanbul, Turkey
2Department Of Haematology, University Of Wales College Of Medicine, Wales, U.k.
In modern medicine, for early diagnosis of infections, tests that have high specificity and sensitivity should be preferred. For this reason, especially for patients with hematological malignancies and transplantation, that have high mortality and morbidity ratios, some molecular biological techniques are coming into use today for differential diagnosis and follow up of invasive fungal infections. In the coming years it will become easier to early diagnose and also to plan optimal treatments, by using these techniques for diagnosis of fungal infections. In this study, we made fungal DNA isolation from blood samples, which were taken from patients, in immunodeficiency state, with hematological malignancies and transplantation. For polymerase chain reaction (PCR), we used universal fungal primers. By using real-time PCR samples from 20 patients, which were found positive by PCR, the amount of DNA was measured. In real-time PCR, we used Aspergillus colonies as our standard, and for this purpose, SDA petri dishes were incubated for 72 hours at 30°C and; 101-106 cfu/mL serial dilutions were made by using hemocytometry. We performed DNA isolation and PCR from these dilutions. Fungal species specific products giving one band of 500 bp, were fixed in 2% agarose gel. We measured the DNA amounts by real-time PCR by using Sybr Green I. Standard dilution series and extraction samples were studied at the same time by real-time PCR. Measurement of the DNA quantities in the separate samples, one at the time of first day and the other after 15 days were interpreted by the LightCycler system. Results of real-time PCR in these two different samples were compared; it was noted that fungal DNA was increased in 5, decreased in 6 and equivalent in 9 patients. These findings showed that real-time PCR is a new, specific and a sensitive method among the other quantitative PCR systems. This method was also quicker than the other quantitative PCR systems. Currently, the investigators prefer this method because, it gives early idea about patient condition, for early diagnosis of infections and treatment patients who are under risk of some kind of infection, and for follow up treatment results. Additionally for diagnosis of fungal infections serial samples in PCR, together with other conventional diagnostic methods, should used. Keywords: Real-time PCR, Invasive fungal infections, Polymerase chain reaction.
Hematolojik Maligniteli Olup Nakil Yapılan Hastalarda Fungal İnfeksiyonların Tanı ve İzlenmesinde PCR ve Real-Time PCR (LightCycler) KullanmıNilgün Işık1, Ken Mills21Department Of Microbiology And Clinical Microbiology, Istanbul Medical Faculty, University Of İstanbul, İstanbul, Turkey
2Department Of Haematology, University Of Wales College Of Medicine, Wales, U.k.
Yüksek mortalite ve morbiditeye sahip olan hematolojik maligniteli ve nakil yapılmış hastalarda, invaziv fungal infeksiyonların tanısı ve izlenmesi için yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip moleküler biyolojik tekniklerin kullanılması gündemdedir. Bu çalışmada hastalardan immünyetmezlik dönemde alınan kan örneklerinden fungal DNA izole edildi. PCR için üniversal fungal primerler kullanıldı. PCR ile pozitif bulunan 20 olguda real-time PCR ile DNA miktarı ölçüldü. Real-time PCR’de Aspergillus kolonileri kontrol olarak kullanıldı. DNA miktar ölçümü Sybr Green I ile yapıldı. Standart dilüsyon serileri ve ekstraksiyon örnekleri real-time PCR ile aynı zamanda ölçüldü. DNA miktar ölçümleri, birinci gün ve 15. gün örneklerinde LightCycler ile yapıldı. Bu iki örnekteki real-time PCR sonuçları karşılaştırıldı. Fungal DNA’nın beş olguda arttığı, altı olguda azaldığı dokuz olguda aynı kaldığı görüldü. Bu bulgular real-time PCR’nin diğer kantitatif PCR yöntemlerine göre daha duyarlı ve özgül olduğunu ve diğer sistemlerden hızlı olduğunu göstermektedir. Halen araştırmacılar bu yöntemi hastanın durumu hakkında erken bilgi vermesi, infeksiyonların erken tanısı ve tedavinin izlenmesinde kullanılabilmesi nedeni ile tercih etmektedir. Fungal infeksiyonların tanısında seri PCR örneklerinin izlenmesi ve diğer konvansiyonel yöntemlerin de kullanılması yararlı olacaktır.Yüksek mortalite ve morbiditeye sahip olan hematolojik maligniteli ve nakil yapılmış hastalarda, invaziv fungal infeksiyonların tanısı ve izlenmesi için yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahip moleküler biyolojik tekniklerin kullanılması gündemdedir. Bu çalışmada hastalardan immünyetmezlik dönemde alınan kan örneklerinden fungal DNA izole edildi. PCR için üniversal fungal primerler kullanıldı. PCR ile pozitif bulunan 20 olguda real-time PCR ile DNA miktarı ölçüldü. Real-time PCR’de Aspergillus kolonileri kontrol olarak kullanıldı. DNA miktar ölçümü Sybr Green I ile yapıldı. Standart dilüsyon serileri ve ekstraksiyon örnekleri real-time PCR ile aynı zamanda ölçüldü. DNA miktar ölçümleri, birinci gün ve 15. gün örneklerinde LightCycler ile yapıldı. Bu iki örnekteki real-time PCR sonuçları karşılaştırıldı. Fungal DNA’nın beş olguda arttığı, altı olguda azaldığı dokuz olguda aynı kaldığı görüldü. Bu bulgular real-time PCR’nin diğer kantitatif PCR yöntemlerine göre daha duyarlı ve özgül olduğunu ve diğer sistemlerden hızlı olduğunu göstermektedir. Halen araştırmacılar bu yöntemi hastanın durumu hakkında erken bilgi vermesi, infeksiyonların erken tanısı ve tedavinin izlenmesinde kullanılabilmesi nedeni ile tercih etmektedir. Fungal infeksiyonların tanısında seri PCR örneklerinin izlenmesi ve diğer konvansiyonel yöntemlerin de kullanılması yararlı olacaktır. Anahtar Kelimeler: Real-time PCR, Ý, nvaziv fungal infeksiyon, Polimeraz zincir reaksiyonu
Nilgün Işık, Ken Mills. Using PCR and Real-Time PCR (LightCycler) for Diagnosis and Follow up of Invasive Fungal Infections in Patients with Hematological Malignancies and Transplantation. Turk J Hematol. 2003; 20(2): 63-68, Türkiye |
|